據相關行業調研數據，截至日前，新(xīn)型冠狀病毒核酸檢測試劑盒研發企業已超過120家，底層技(jì )術應用(yòng)原理(lǐ)大都是以基因擴增技(jì )術打底。而這背後所折射出來的，其實就是分(fēn)子診斷技(jì )術大家族。

未來3-5年IVD行業最具(jù)發展潛力的産(chǎn)品線(xiàn)是什麽?答(dá)案無疑是分(fēn)子診斷。

新(xīn)型冠狀病毒核酸檢測試劑研發—分(fēn)子診斷技(jì )術應用(yòng)

總的來講，分(fēn)子診斷技(jì )術是指以DNA和RNA為(wèi)診斷材料，用(yòng)分(fēn)子生物(wù)學(xué)技(jì )術通過檢測基因的存在、缺陷或表達異常，從而對人體(tǐ)狀态和疾病作(zuò)出診斷的技(jì )術。其基本原理(lǐ)是檢測DNA或RNA的結構是否變化、量的多(duō)少及表達功能(néng)是否異常，以确定受檢者有(yǒu)無基因水平的異常變化，對疾病的預防、預測、診斷、治療和預後具(jù)有(yǒu)重要意義。

按照技(jì )術原理(lǐ)，可(kě)以将上市分(fēn)子診斷技(jì )術大緻劃分(fēn)為(wèi)PCR技(jì )術、分(fēn)子雜交、基因測序、核酸質(zhì)譜、生物(wù)芯片5大類。

分(fēn)子診斷技(jì )術大家族

截止2020年3月，分(fēn)子診斷産(chǎn)品獲批數量超1200項。從目前市場分(fēn)子診斷産(chǎn)品來看，基于核酸診斷技(jì )術的産(chǎn)品仍占主要。從各類技(jì )術類别來看，PCR技(jì )術由于壁壘相對較低，國(guó)産(chǎn)化程度高，國(guó)内企業布局相對較早，因此基于PCR技(jì )術的分(fēn)子診斷産(chǎn)品占總産(chǎn)品量的70%以上。

從此次新(xīn)型冠狀病毒肺炎産(chǎn)品注冊就可(kě)以看出，PCR技(jì )術發展已經很(hěn)成熟了。下面我們就來逐一解剖一下分(fēn)子診斷技(jì )術這個大家庭！

01

基因擴增技(jì )術（PCR技(jì )術）

在1983年，美國(guó)人Mullis發明了聚合酶鏈反應技(jì )術(polymerase chain reaction, PCR),這一技(jì )術将DNA的變性原理(lǐ)以及複性原理(lǐ)加以利用(yòng)，采用(yòng)适溫延伸、高溫變性以及低溫複性，讓核酸片段實現了體(tǐ)外擴增，可(kě)将極微量的目标DNA特異地擴增上百萬倍，從而提高對DNA分(fēn)子的分(fēn)析和檢測，因為(wèi)PCR有(yǒu)着很(hěn)高的靈敏度以及特異性，而且簡便快速，所以這種技(jì )術已經成為(wèi)目前臨床基因擴增實驗室接受程度最高的技(jì )術。同時，PCR技(jì )術又(yòu)可(kě)以分(fēn)為(wèi)定量PCR和常規PCR，定量PCR分(fēn)為(wèi)實時熒光定量PCR（RT-PCR）和數字PCR。

PCR技(jì )術大緻分(fēn)類

但伴随着PCR技(jì )術的迅猛發展,有(yǒu)關這項技(jì )術的質(zhì)量管理(lǐ)問題也日益突出,如何消除各類生物(wù)學(xué)變量所引起的檢測變異,減少或抑制實驗操作(zuò)與方法學(xué)中(zhōng)的各種幹擾因素是PCR技(jì )術面臨的難題。比如此次新(xīn)型冠狀病毒核酸檢測假陰性問題，就是技(jì )術面臨的一些現實問題。

02

基因測序技(jì )術

基因測序是直接獲得核酸序列信息的唯一技(jì )術手段,是分(fēn)子診斷技(jì )術的一項重要分(fēn)支。雖然分(fēn)子雜交、分(fēn)子構象變異或定量PCR技(jì )術在近幾年已得到了長(cháng)足的發展,但其對于核酸的鑒定都僅僅停留在間接推斷的假設上,因此對基于特定基因序列檢測的分(fēn)子診斷,核酸測序仍是技(jì )術上的金标準。

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第1代測序

1975年Sanger與Coulson發表了使用(yòng)加減法進行DNA序列測定的方法,随後Maxam在1977年提出了化學(xué)修飾降解法的模型,為(wèi)核酸測序時代的來臨拉開了序幕。經典的Sanger測序技(jì )術，被稱作(zuò)是測序界的金标準。随着高通量測序技(jì )術應用(yòng)拓展，基因測序技(jì )術将不斷升級，也将進一步提高占比，成為(wèi)未來腫瘤檢測的主要技(jì )術。目前測序市場主流為(wèi)NGS測序平台。

第二代測序

NGS高通量測序技(jì )術又(yòu)稱第二代的測序技(jì )術，就是對幾百萬到數十億的DNA分(fēn)子一次性實現并行測序。可(kě)對一個物(wù)種的全部轉錄組和基因組進行深入、細緻地分(fēn)析。在基因組水平上對未知序列的物(wù)種進行從頭測序，獲得該物(wù)種的基因序列，為(wèi)後續的進一步研究奠定基礎；進行參考序列物(wù)種的全基因組測序，并在全基因組這一水平之上進行突變位點的檢測，發現個體(tǐ)差異的分(fēn)子變化。

第三代測序

第三代測序技(jì )術的核心理(lǐ)念是以單分(fēn)子為(wèi)目标的邊合成邊測序，單分(fēn)子測序平台給測序技(jì )術帶來新(xīn)思路，部分(fēn)已經開始商(shāng)業化推廣，但尚未達到NGS的規模。

相比二代測序，第三代測序技(jì )術在臨床上的應用(yòng)有(yǒu)明顯優勢：第三代測序技(jì )術不需要PCR擴增，可(kě)直接對單個分(fēn)子進行測序;樣品制備簡單，測序成本進一步降低；可(kě)直接讀取RNA的序列和包括甲基化在内的DNA修飾。這些優勢可(kě)以大大改善臨床基因測序的成本、速度和質(zhì)量，但單分(fēn)子測序有(yǒu)通量限制，所以并不适合獨立做全基因組測序，更适于針對有(yǒu)限的、個性化的、目标性的應用(yòng)。

03

分(fēn)子雜交技(jì )術

分(fēn)子雜交就是指兩條有(yǒu)着同源序列的核酸單鏈，通過堿基互補配對這一原則相結合，進而形成雙鏈的這一過程，它能(néng)夠通過已知序列的基因探針對目标序列加以捕獲和檢測。

進行雜交的雙方分(fēn)别是探針以及有(yǒu)待探測的核酸，有(yǒu)待檢測的對象可(kě)以選擇基因組的DNA,也可(kě)以選擇細胞總DNA,可(kě)以對其進行提純，也可(kě)以對其進行細胞之内的雜交，也就是細胞原位雜交。必須對探針進行标記，這樣才可(kě)以進行示蹤以及檢測。

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同位素是最為(wèi)普遍應用(yòng)的探針标記物(wù)，多(duō)使用(yòng)類化合物(wù)地高辛配基（digoxigenin,DIG)标記。核酸分(fēn)子雜交因具(jù)有(yǒu)高靈敏度和高特異性，在分(fēn)子生物(wù)學(xué)領域中(zhōng)已廣泛地使用(yòng)于克隆基因的篩選、基因組中(zhōng)特定基因序列的定性、定量檢測等方面因為(wèi)核酸分(fēn)子雜交的靈敏度以及特異性都很(hěn)高，因此這一技(jì )術已經在克隆基因篩選以及基因組之中(zhōng)待測的基因序列定性、定量檢測之中(zhōng)得到了廣泛的應用(yòng)。

04

核酸質(zhì)譜技(jì )術

目前核酸分(fēn)析所使用(yòng)的質(zhì)譜電(diàn)離技(jì )術主要還是采用(yòng) ESI 和MALDI。簡單來講，兩種電(diàn)離技(jì )術都是軟電(diàn)離，ESI 檢測的特點是生物(wù)大分(fēn)子帶多(duō)個電(diàn)荷，質(zhì)荷比範圍基本在2000 Da 以下區(qū)間，從而能(néng)檢測幾萬乃至更大的生物(wù)分(fēn)子；而MALDI 常得到單電(diàn)荷峰，與飛行時間(TOF)分(fēn)析器搭配，檢測範圍可(kě)以到幾十萬道爾頓。

質(zhì)譜技(jì )術相比于其他(tā)檢測技(jì )術具(jù)有(yǒu)快速、準确、靈敏度高、高通量等優點，近年來在核酸的高級結構鑒定、寡核苷酸與小(xiǎo)分(fēn)子的相互作(zuò)用(yòng)、DNA 損傷與修飾等領域有(yǒu)着廣泛的應用(yòng)。

由于生物(wù)樣品的複雜性，質(zhì)譜技(jì )術還面臨着一些挑戰和困難。但生物(wù)質(zhì)譜技(jì )術是科(kē)學(xué)研究的有(yǒu)力工(gōng)具(jù)，随着臨床實驗室對質(zhì)譜的了解和應用(yòng)不斷的加深，未來該檢測平台或可(kě)成為(wèi)規範實驗室不可(kě)或缺的标準裝(zhuāng)備。

05

生物(wù)芯片技(jì )術

生物(wù)芯片技(jì )術在最近的一些年裏才得到了發展，這種分(fēn)析與檢測的技(jì )術将分(fēn)子生物(wù)學(xué)以及微電(diàn)子技(jì )術之間進行有(yǒu)效結合。因此，這種技(jì )術又(yòu)被稱作(zuò)基因芯片技(jì )術或者是DNA芯片技(jì )術。在當今，這一技(jì )術在免疫反應以及受體(tǐ)結合等的這些非核酸領域之中(zhōng)得到了廣泛的擴展，出現了組織芯片、細胞芯片、免疫芯片以及蛋白質(zhì)芯片等，所以又(yòu)将官這種技(jì )術改稱作(zuò)生物(wù)芯片技(jì )術。

生物(wù)芯片技(jì )術是通過微加工(gōng)和微電(diàn)子技(jì )術，在固相基質(zhì)表面集成密集排列的分(fēn)子微陣列，以實現對核酸、細胞、蛋白質(zhì)、組織以及其他(tā)生物(wù)分(fēn)子進行高效、準确的檢測。生物(wù)芯片技(jì )術的本質(zhì)特征是将生命科(kē)學(xué)研究中(zhōng)的樣品制備、生化反應以及檢測分(fēn)析等過程實現連續化、集成化及微型化。

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微陣列芯片

也就是常說的基因芯片，又(yòu)稱DNA微陣列(DNA micro-array)、SNP芯片，是把大量已知序列探針集成在同一個基片(如玻片、膜)上，經過标記的若幹靶核苷酸序列與芯片特定位點上的探針雜交，通過檢測雜交信号，對生物(wù)細胞或組織中(zhōng)大量的基因信息進行分(fēn)析。

與傳統的染色體(tǐ)核型分(fēn)析技(jì )術相比具(jù)有(yǒu)更高的分(fēn)辨率，可(kě)識别Kb級别以上的染色體(tǐ)細微失衡。基因芯片目前已成為(wèi)國(guó)内外臨床遺傳學(xué)診斷的一項常規的技(jì )術，在遺傳病檢測、疾病篩查、疾病分(fēn)型、病原體(tǐ)檢測、個性化用(yòng)藥等方面均呈現出廣闊的應用(yòng)前景。全球知名(míng)的芯片公(gōng)司有(yǒu) Illumina、Affymetrix(于2016年被賽默飛收購(gòu))、安(ān)捷倫等。

微流控芯片

微流控芯片( microfluidic chip) 由微米級流體(tǐ)的管道、反應器等元件構成，與宏觀尺寸的分(fēn)析裝(zhuāng)置相比，其結構極大地增加了流體(tǐ)環境的面積/體(tǐ)積比，以最大限度利用(yòng)液體(tǐ)與物(wù)體(tǐ)表面有(yǒu)關的包括層流效應、毛細效應、快速熱傳導和擴散效應在内的特殊性能(néng)，從而在一張芯片上完成樣品進樣、預處理(lǐ)、分(fēn)子生物(wù)學(xué)反應、檢測等系列實驗過程。目前使用(yòng)微流控芯片進行指導用(yòng)藥的多(duō)基因位點平行檢測是主要臨床應用(yòng)領域。

06

總結：分(fēn)子診斷市場未來可(kě)期！

分(fēn)子診斷技(jì )術的應用(yòng)不僅深化對疾病發病機制分(fēn)子生物(wù)學(xué)的基礎研究，而且不斷擴大了分(fēn)子診斷疾病的病種，随着人類基因組計劃的完成和蛋白質(zhì)組計劃的啓動，分(fēn)子診斷方法将極大地推動現代檢驗醫(yī)學(xué)的迅速發展，并通過這些基本技(jì )術的衍生、聯合産(chǎn)生新(xīn)的分(fēn)析方法，從而提高分(fēn)子診斷的特異性、敏感性和準确性，為(wèi)臨床醫(yī)學(xué)診斷和治療提供更準确的數據和信息。

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